Введение

Общий анализ крови (ОАК) — один из важнейших диагностических методов, тонко отражающих реакцию кроветворных органов на воздействие различных физиологических и патологических факторов. Данные, полученные при его выполнении, представляют собой интегральные показатели состояния гемопоэтической системы, зрелые элементы которой осуществляют основные защитные функции организма и принимают активное участие во всех видах обмена .

Количественные и качественные изменения форменных элементов крови характерны для многих инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной этиологии. Наиболее выраженные изменения в периферической крови наблюдаются при герпетических инфекциях, кори, краснухе, ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитах и др. .

Инфекционный мононуклеоз — острое инфекционное заболевание, вызываемое герпетическими вирусами 4, 5, 6-го типов, характеризующееся лихорадочным состоянием, ангиной, увеличением лимфатических узлов, печени и селезенки .

В настоящее время инфекционный мононуклеоз следует считать полиэтиологическим заболеванием. Согласно МКБ -10 выделяют: инфекционный мононуклеоз, вызванный гамма-герпетическим вирусом Эпштейн-Барр (В27.01); цитомегаловирусный мононуклеоз (В27.1);

другой инфекционный мононуклеоз (В27.8); инфекционный мононуклеоз неуточненный (В27.9).

Основными проявлениями инфекционного мононуклеоза, определяющими его сущность и название, служат изменения в периферической крови, которые возникают в первые дни болезни и достигают максимума в ее разгар. Это умеренный лейкоцитоз, увеличение количества одноядерных элементов крови (лимфомоноцитоз), умеренное повышение СОЭ . В начале болезни у большинства больных значительно снижается содержание сегментоядерных нейтрофилов и увеличивается количество палочкоядерных. Самым характерным признаком инфекционного мононуклеоза является наличие атипичных мононуклеаров, которые появляются в разгар болезни и сохраняются 2-3 недели. На ранних стадиях — это В-лимфоциты, содержащие специфические иммуноглобулины в цитоплазме. В последующие стадии большую часть атипичных мононуклеаров составляют Т-клетки .

Диагностическое значение имеет увеличение количества атипичных мононуклеаров с широкой цитоплазмой не менее чем до 10-12%, хотя число этих клеток может достигать 80-90%. Следует заметить, что отсутствие атипичных мононуклеаров при характерных клинических проявлениях заболевания не противоречит предполагаемому диагнозу, поскольку их появление в периферической крови может задерживаться до конца 2-3-й недели болезни .

При обследовании детей с инфекционным мононуклеозом анализ крови обычно включает определение количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, подсчёт лейкоцитарной формулы, определение концентрации гемоглобина, СОЭ, вычисление цветового показателя и гематокрита (Ht).

Данные общего анализа крови позволяют получить комплексное представление о тяжести течения инфекционного мононуклеоза, наслоении бактериальной инфекции, эффективности проводимой терапии.

Цель исследования — выявление закономерностей изменения показателей периферической крови у детей при инфекционном мононуклеозе различной этиологии.

Материалы и методы исследования

Под нашим наблюдением находилось 140 детей с инфекционным мононуклеозом в возрасте от 1 до 15 лет, проходивших стационарное лечение в Волгоградской областной детской клинической инфекционной больнице. Верификацию возбудителя осуществляли с помощью молекулярно-генетического (ПЦР) метода исследования. Также всем больным проводилось комплексное обследование, которое включало в себя общеклинические (сбор анамнеза, осмотр, пальпацию, перкуссию, аускультацию) и лабораторно-инструментальные методы: общие анализы крови и мочи, биохимические тесты (АЛТ, АСТ, коэффициент де Ритиса, тимоловые пробы), УЗИ органов брюшной полости.

Общий анализ периферической крови проводился в клинической лаборатории с использованием автоматического гематологического анализатора «МЕК-6400». Он включал в себя определение количества эритроцитов, гемоглобина, гематокрита, лейкоцитов (с подсчетом лейкоцитарной формулы), СОЭ, тромбоцитов. В дополнение к результатам, полученным при помощи автоматического счетчика, производилась традиционная окраска мазков с подсчетом формулы «белой» крови на стекле.

С целью определения степени интоксикации и выраженности гнойно-воспалительного процесса в ротоглотке при инфекционном мононуклеозе у детей производили расчёт лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ). Определение ЛИИ имело важное значение как для контроля за лечением, так и для прогноза заболевания.

Существует несколько способов расчета лейкоцитарного индекса интоксикации. Нами была выбрана формула В.К. Островского (1983), в которой в числителе находится сумма процентного содержания клеток миелоидного ряда, а в знаменателе — сумма остальных клеток белой крови .

Формула расчёта ЛИИ,

ПК + миел. + ю. + п. + с.
ЛИИ = ————————————————-
Лимф. + мон. + э. + б.

Результаты и их обсуждение

Данные, полученные при исследовании носоглоточной слизи и сыворотки крови у 140 детей методом ПЦР, показали, что на долю классического ИМ, вызванного Эпштейн-Барр вирусом (ЭБВ), приходилось 74,3% всех случаев. У 1/3 детей мононуклеоз был обусловлен другими возбудителями: в 9,2% — цитомегаловирусом (ЦМВ), в 8,6% — микст-инфицированием ЦМВ и ЭБВ, у 7,9% детей этиологию заболевания установить не удалось.

Далее нами был проведен анализ гемограмм наблюдаемых детей с учетом этиологии заболевания. Полученные данные представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1 — Частота встречаемости патологических изменений показателей ОАК при инфекционном мононуклеозе различной этиологии

Таблица 2 — Средние значения патологических показателей ОАК при инфекционном мононуклеозе различной этиологии

Оценка данных таблиц показала, что при Эпштейн-Барр вирусном мононуклеозе лейкоцитоз отмечался у 43,3% больных, лейкопения — у 2,9%. Количество лейкоцитов колебалось в широких пределах — от 4,0х109 г/л до 32,7х109 г/ л и в среднем составляло 16,3±5,3х109 г/л. Характерным для ИМ-ЭБВ этиологии изменением в периферической крови было снижение сегментоядерных нейтрофилов (в среднем до 18,1±8,2%), что отмечалось у 39,4% детей. Нейтрофилез встречался редко и был зафиксирован только у 7,7% больных. В 16,3% случаев у детей с ИМ-ЭБВ этиологии в ОАК отмечался палочкоядерный сдвиг влево. Количество палочкоядерных нейтрофилов колебалось от 0 до 42%, составляя в среднем — 11,4±8,9%.

Процентное содержание лимфоцитов в периферической крови у детей было разнообразным и варьировало от 2,0 до 85,0%. Лимфоцитоз, при сравнении с нормальными возрастными показателями, был выявлен у 21,2% обследованных, лимфопения — у 15,4%. Нарастание моноцитов отмечалось у 23,0% детей, их среднее значение составило — 15,6±3,3%.

Наличие в периферической крови атипичных мононуклеаров при инфекционном мононуклеозе Эпштейн-Барр вирусной этиологии являлось кардинальным симптомом и встречалось в 74,0% случаев. Количество плазматических клеток было разнообразным и в большинстве случаев зависело от сроков заболевания. Так, у 39,4% больных их значение не превышало 10% и в среднем равнялось 5,5±2,8%. У 34,6% — количество атипичных мононуклеаров в крови было более 10% и имело среднее значение — 21,9±1,7%.

Помимо перечисленных изменений лейкоцитарной формулы, для Эпштейн-Барр вирусной инфекции были характерны и специфические изменения «красной» крови. Так, эритроцитоз, связанный со сгущением крови на фоне длительной и выраженной интоксикации, отмечался у 12,5% больных, повышение гемоглобина (в среднем до 149±7,1 г/л) — у 4,8%. Гипохромная анемия различной степени выявлялась у 25,0% детей. Снижение гемоглобина чаще было выражено умеренно (от 109 до 94 г/л) и в среднем составляло 104±3,9 г/л. Характерным для ИМ-ЭБВ этиологии изменением показателей «красной» крови также было снижение уровня гематокрита, которое отмечалось у 50,0% детей. Размах показателей концентрации гематокрита был в пределах от 24,6 до 31,4%, его среднее значение было 29,1±1,4%.

Тромбоцитопения была частым симптомом ЭБВ-инфекции и выявлялась у 52,9% больных. Значение показателей тромбоцитов колебалось в пределах от 81х109 до 173х109 г/л и в среднем составляло 131±14,5х109 г/л.

Ускорение СОЭ отмечалось у 34,6% детей при ЭБВ-инфекции. Значения данного показателя были разнообразными и колебались от 13 до 50 мм/час, в среднем составляя 24±10,9 мм/час.

Цитомегаловирусная инфекция была подтверждена у 13 детей, поступавших в стационар с диагнозом инфекционный мононуклеоз. Характерными особенностями ОАК крови при ЦМВ-инфекции были: значительный лейкоцитоз со сдвигом влево и повышением общего количества лейкоцитов до 17,5±6,6х109 г/л, который наблюдался у 1/3 больных, нейтропения (у 23,0%), лимфоцитоз (23,0%), эритроцитоз (30,8%), гипохромная анемия (30,8%), тромбоцитопения (53,8%), выраженное снижение гематокрита, в среднем до 25,7 ±1,2 г/л, что наблюдалось у 61,5% детей. Обращала на себя внимание высокая частота встречаемости атипичных мононуклеаров в периферической крови у больных цитомегаловирусной инфекцией (84,6%), причем их количество в подавляющем большинстве случаев превышало 10% и в среднем составляло 17,5±2,1%.

СОЭ при ЦМВ-инфекции чаще соответствовало возрастной норме, ее ускорение отмечалось лишь у 23,0% детей.

Инфекционный мононуклеоз, обусловленный одновременным инфицированием Эпштейн-Барр и цитомегаловирусом, был диагностирован у 12 детей. Изменение показателей ОАК при микст-инфекции также имело характерные особенности: лейкопения за счет снижения сегментоядерных нейтрофилов, что выявлялось в 33,3% случаев, выраженный лимфоцитоз (у 33,3%) с повышением количества лимфоцитов в среднем до 74,3±13,2%, нормальное содержание моноцитов. Атипичные мононуклеары при микст-инфекции обнаруживались в крови у 33,3% больных, что было вдвое реже, чем при изолированных Эпштейн-Барр и ЦМВ-инфекциях. Их количество в подавляющем большинстве случаев не превышало 10% и в среднем соответствовало 8,2±2,4%.

Характерной особенностью инфекционного мононуклеоза смешанной этиологии была высокая частота встречаемости ускоренной СОЭ, что было выявлено у 58,3% больных. Данный показатель колебался в пределах от 13 до 40 мм/час, в среднем составляя 21±9,9 мм/час.

Установить этиологию инфекционного мононуклеоза не удалось у 11 из 140 обследованных детей. Они были выписаны из стационара с заключительным диагнозом — «Инфекционный мононуклеоз неуточненной этиологии». Характерных особенностей ОАК у больных этой группы выявлено не было. Практически с равной частотой у них встречались умеренно-выраженные изменения со стороны периферической крови как в сторону повышения, так и в сторону снижения показателей. Так, умеренный лейкоцитоз встречался у 36,4%, лейкопения — у 18,2%; нейтрофиллез и нейтропения равнозначно у 18,2%; лимфоцитоз — у 27,3%, лимфопения — у 18,2%; эритроцитоз — у 27,3%, гипохромная анемия — у 27,3%, снижение гематокрита — у 72,7%. Тромбоцитопения выявлялась более чем в половине случаев (у 54,5%), среднее значение количества тромбоцитов составило 141±15,3х109 г/л. Атипичные мононуклеары обнаруживались в крови у большинства больных (у 63,6%), их среднее количество составляло 13,3±5,2%.

СОЭ была ускоренной у 54,5% детей, колебалась в пределах от 15 до 36 мм/час, в среднем не превышала 21±7,9 мм/час.

Для оценки степени интоксикации и выраженности гнойно-воспалительного процесса в ротоглотке при инфекционном мононуклеозе у детей мы производили расчёт лейкоцитарного индекса интоксикации (табл. 3).

Таблица 3 — Значение лейкоцитарного индекса интоксикации при инфекционном мононуклеозе различной этиологии

Анализируя данные табл. 3, можно сделать вывод, что для всех изучаемых состояний характерно выраженное снижение лейкоцитарного индекса интоксикации. Очевидно, этот факт связан с вирусной этиологией заболевания. Обладая лимфопролиферативными свойствами, все герпесвирусы приводят к увеличению количества клеток лимфоцитарно-моноцитарного звена и нарастанию нейтропении. Выраженные гнойно-воспалительные изменения в ротоглотке, свойственные для ИМ, вероятнее всего, носят асептический характер и не требуют назначения антибактериальной терапии .

Выводы

• 1. Инфекционный мононуклеоз является полиэтиологическим заболеванием, имеющим как клинические, так и лабораторные особенности течения в зависимости от типа возбудителя.
• 2. Общий анализ крови является самым доступным и информативным методом для проведения дифференциальной диагностики на ранней стадии инфекционного мононуклеоза у детей.

Рецензенты:

Иоанниди Елена Александровна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней с эпидемиологией и тропической медициной ВолгГМУ, ГУЗ «Волгоградская областная клиническая инфекционная больница № 1», г. Волгоград.

Борзенко Александр Сергеевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фтизиопульмонологии ВолгГМУ, ГУЗ «Волгоградский областной противотуберкулезный диспансер», г. Волгоград.

Для увеличения жизнестойкости нервных клеток при нейродегенеративных заболеваниях после травматических и ишемических повреждений многолетние исследования in vitro и in vivo выявили наиболее значимые нейротрофические и нейропротекторные факторы, которые могут быть применены в качестве лекарственных препаратов. К ним относятся мозговой нейротрофический фактор (BDNF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Одним из перспективных способов доставки поддерживающих выживание нейронов факторов считается трансплантация генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих рекомбинантные терапевтические гены. В статье приводится технология создания клеточных носителей терапевтических генов на основе мононуклеарной фракции пуповинной крови человека и двухкассетных плазмид, одновременно экспрессирующих два терапевтических гена. Эффективность экспрессии трансгенов изучена in vitro методом ПЦР-РВ. Анализ выживания, миграции и фенотипа генетически модифицированных клеток исследовали через 2 нед. после трансплантации трансгенным мышам с фенотипом бокового амиотрофического склероза.

Целесообразность генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови для клеточной терапии в регенеративной медицине обусловлена: повышением жизнеспособности трансплантированных клеток в тканях реципиента; адресной доставкой специфических ростовых и трофических факторов в область дегенерации; направленной дифференцировкой прогениторных и стволовых клеток пуповинной крови. Ранее на основе плазмидного вектора pcDNA3.1 нами были получены генетические конструкции, экспрессирующие нейрональную молекулу адгезии L1 (pcDNA-hL1CAM), сосудистый эндотелиальный фактор роста (pcDNA-VEGF121, pcDNA-VEGF165, pcDNA-VEGF189), фактора роста фибробластов (pcDNA-FGF2), глиальный нейротрофический фактор (pcDNA-GDNF). Согласно нашей гипотезе, адресную доставку терапевтического гена в нервную ткань можно эффективнее осуществлять с помощью генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови, одновременно экспрессирующих терапевтический ген и ген молекулы адгезии нервных клеток. Нами впервые была создана генетическая конструкция, кодирующая VEGF и L1CAM. Экспрессия гена молекулы адгезии нейронов в генетически модифицированных клетках может не только повысить их способность к адресной миграции, но и выживаемость в нервной ткани реципиента, а следовательно, увеличится продолжительность действия терапевтического гена на нервные клетки . Одновременно нами решалась задача о возможности доставки в область регенерации нервной ткани сразу двух терапевтических генов. С этой целью нами была создана двухкассетная плазмида, кодирующая VEGF и FGF2 . В настоящем исследовании нами разработана новая двухкассетная плазмидная конструкция, одновременно экспрессирующая VEGF и глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Эффективность трансфекции мононуклеарных клеток пуповинной крови оценивали in vitro. Возможность применения полученных генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови для стимулирования нейрорегенерации исследовали на трансгенных G93A мышах с фенотипом бокового амиотрофического склероза.

Материал и методы

Создание двухкассетных плазмидных конструкций. Создание генетических конструкций pBud-VEGF-FGF2, pBud-EGFP и pBud-VEGF-L1CAM, экспрессирующих vegf, fgf2, egfp и l1cam, было описано ранее . Аналогично описанной стратегии была создана конструкция pBud-VEGF-GDNF. Исходя из нуклеотидных последовательностей, представленных в базе данных GeneBank, разработаны специфические праймеры для ПЦРамплификации полной открытой рамки считывания гена gdnf (5’-ggtaccaccatgaagttatgggatgtcgtg-3’, 5’-ggtaccaccatgaagttatgggatgtcgtg-3’). 5’- и 3’праймеры содержали адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции KpnI и XhoI, применяемые для клонирования гена в экспрессионный плазмидный вектор pcDNA 3.1(+) (Invitrogen, США). Матрицей для ПЦР-амплификации гена послужила плазмида pLVPT-GDNF-tTR-KRAB . Ко-экспрессирующие векторы собраны на основе pBudCE4.1 (Invitrogen, США) субклонированием гена gdnf под контролем промотора CMV по сайтам рестрикции HindIII и XbaI и изоформы vegf165 под контролем промотора EF-1α по сайтам рестрикции KpnI и XhoI. Конечное подтверждение получения экспрессионной плазмиды pBud-VEGF-GDNF осуществляли с помощью ДНК-секвенирования с применением стандартных вектор-специфических праймеров.

Получение генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови. Выделение клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови человека производили из свежих образцов крови при помощи седиментации в градиенте плотности фиколла (ρ = 1,077 г/мл). Затем клетки отмывали фосфатносолевым буфером, эритроциты лизировали в гипотоническом растворе и оставшиеся мононуклеарные клетки использовали для трансфекции .

Трансфекцию клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови человека проводили с помощью электропорации в 4 мм электропорационных кюветах на приборе Gene Pulser Xcell Electroporation System (BioRad, США). После воздействия электрического импульса клетки переносили в культуральный флакон и добавляли среду Игла, модифицированную по методу Дульбекко (Sigma, США), содержащую 10% сыворотки крови плодов коров (Sigma, США), 2 мM L-глутамина и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Sigma, США) .

Количественная оценка экспрессии мРНК генов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Общую РНК из клеточных осадков выделяли с помощью набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора Omniscript Reverse Transcriptase Kit (Qiagen, США). Количественный анализ уровня экспрессии мРНК генов β-actin, fgf2 и vegf проводили на приборе iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Каждая реакция включала в себя универсальный мастер микс для ПЦР, специфичные прямой и обратный праймеры, флуоресцентную пробу TagMan (Синтол, Россия) и целевую кДНК. Последовательности праймеров и проб представлены в табл. 1. Серийное разведение кДНК, синтезированной из мРНК трансфицированных клеток, использовали для построения стандартной кривой и определения уровня экспрессии гена. Количество РНК было нормализовано по β-актину .

Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.

Ксенотрансплантация генетически модифицированных клеток трансгенным G93A мышам. Доклинические испытания полученных генно-клеточных конструкций были проведены на трансгенных мышах B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J, приобретённых из питомника лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и академика Ю.А. Овчинникова РАН (филиал ИБХ РАН). Данная линия мышей характеризуется присутствием в геноме аллелей мутантного гена человека – Cu/Zn-супероксиддисмутазы sod1 (Gly93→Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93), в результате чего у мышей развивается заболевание, напоминающее боковой амиотрофический склероз человека. В виварии Казанского государственного медицинского университета половозрелые самцы и самки в возрасте 24–28 нед. были разделены на две группы по 3–4 мыши для трансплантации генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных: 1) плазмидными векторами pBud-EGFP; 2) pBud-VEGF-GDNF. Трансплантацию выполняли путём инъекции 1×106 генетически модифицированных клеток в ретроорбитальное пространство экспериментальных животных. Через 2 нед. после трансплантации мышей наркотизировали, через большой круг кровообращения транскардиально вводили сначала холодный фосфатно-солевой буфер (ФС) (рН = 7,4), затем – холодный 4% раствор параформальдегида (рН = 7,4). Спинной мозг извлекали из позвоночного столба, постфиксировали в растворе параформальдегида, после чего, в целях криопротекции, фиксированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы.

Иммунофлуоресцентный метод. Для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания готовили криостатные серийные продольные срезы спинного мозга толщиной 20 мкм. С целью оптимизации связывания антител (АТ) с антигенами (АГ) срезы обрабатывали 0,01 M раствором цитрата натрия (pH 9,0) при 70°C на водяной бане в течение 30 мин . После охлаждения срезов до комнатной температуры и промывки в ФС буфере блокировали неспецифические места связывания в ФС буфере, содержащем 0,2% Тритон X-100, 0,02% азид натрия и 5% сыворотку осла, в течение 1 ч при комнатной температуре. Для идентификации АГ срезы инкубировали с первичными АТ (табл. 2) в течение 3 сут. при 4°C, промывали в ФС буфере и затем инкубировали со вторичными АТ осла, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa 594 или Dy Light 649 (разведение 1:200), в течение 2 ч при комнатной температуре. Для визуализации клеточных ядер срезы дополнительно окрашивали в течение 20 мин. при комнатной температуре раствором бис-бензимида (краситель Hoechst 33258, 5 мкг/мл в ФС буфере, Sigma, США). Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и исследовали при помощи лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss Axiovert 200M, Германия).

Результаты

Экспрессия vegf, и fgf2 в трансфицированных мононуклеарных клетках пуповинной крови человека. Мононуклеарные клетки выделяли из свежей пуповинной крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Полученные клетки трансфицировали плазмидными векторами pBud-EGFP, pBud-VEGF-GDNF, pBud-VEGF-FGF2 и pBud-VEGF-L1САМ с помощью электропорации. Уровень мРНК генов vegf и fgf2 в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека определяли через 24 ч после трансфекции (рис. 1). Результаты проведенного анализа показали, что уровень мРНК исследуемых генов в трансфицированных клетках существенно превысил уровень соответствующих мРНК в трансфицированных egfp клетках, что свидетельствует об эффективной экспрессии рекомбинантных генов в мононуклеарных клетках in vitro.

Иммунофенотипирование генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека в спинном мозге трансгенных G93A мышей. Для идентификации и иммунофенотипирования мононуклеарных клеток, трансдуцированных плазмидой pBud-VEGF-GDNF, было проведено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание продольных срезов спинного мозга мышей с помощью АТ против ядерного АГ человека (HNA) и АТ против одного из клеточных маркёров (эндотелиальных клеток – CD34, астроцитов – S100, олигодендроцитов – OSP и микроглии – Iba1).

Через 2 нед. после трансплантации генетически модифицированных клеток в спинном мозге подопытных мышей были обнаружены HNA-позитивные клетки. Генетически модифицированные клетки, экспрессирующие EGFP, при двойном иммунофлуоресцентном окрашивании реагировали с АТ к HNA и маркёру микроглии Iba1 (HNA+/Iba1+-клетки), или маркёру эндотелиальных клеток CD34 (HNA+/ CD34+-клетки) (рис. 2). HNA+/Iba1+-клетки по своим морфологическим признакам напоминали клетки микроглии. Они имели небольшое «тело» овальной формы с многочисленными короткими отростками (рис. 3). Иммунофенотипирование генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих GDNF и VEGF, с применением маркёров нервных клеток (нейрональная форма β-III тубулина), эндотелиальных клеток (CD34), астроцитов (S100), олигодендроцитов (OSP) и микроглии (Iba1) не обнаружило признаков принадлежности клеток ни к одному из клеточных типов ЦНС (рис. 4).

Обсуждение

Многолетние исследования in vitro и in vivo выявили наиболее значимые нейротрофические и нейропротекторные факторы, которые могут быть применены в качестве лекарственных препаратов для стимулирования нейрорегенерации. К ним относятся мозговой нейротрофический фактор (BDNF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) . При этом установлено, что комбинации нескольких нейротрофических факторов могут иметь более выраженный эффект на выживание нервных клеток. Одним из перспективных способов доставки поддерживающих выживание нейронов факторов считается трансплантация генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих клонированные терапевтические гены. Однако в настоящее время проводимые доклинические и клинические испытания клеточных носителей терапевтических генов не выявили наиболее эффективную генно-клеточную конструкцию для стимулирования нейрорегенерации.

В наших экспериментах в качестве клеточного носителя были выбраны мононуклеарные клетки пуповинной крови человека. Важно заметить, что мононуклеарные клетки пуповинной крови способны проникать через гематоэнцефалический барьер, а сигнальные молекулы, секретируемые погибающими нервными клеткми, могут усиливать хоуминг мононуклеаров в ЦНС. Полученные нами результаты по трансплантации генетически модифицированных монононуклеарных клеток крови пуповины мышам G93A свидетельствуют, что трансплантированные клетки могут служить не только источником рекомбинантных ростовых и трофических факторов, но и дифференцироваться в паренхиматозные клетки ЦНС. Так, EGFP-трансфицированные клетки, экспрессирующие репортёрный ген, могут дифференцироваться в клетки микроглии (Iba1-позитивные) или эндотелиальные клетки (CD34-позитивные). Другими словами, мононуклеарные клетки крови пуповины реализуют свой эндогенный потенциал, т.е. моноциты дифференцируются в макрофаги, а прогениторные эндотелиальные клетки в эндотелий. Интересно, что после трансфекции плазмидным вектором pBud-VEGF-FGF2 мононуклеарные клетки крови пуповины дифференцируются в S-100-позитивные клетки. При этом не стоит рассчитывать на замещение утраченных нейронов новыми клетками. Все выявленные HNA+-клетки не реагировали с АТ против маркёра нервных клеток нейрональной формы β-III тубулина (HNA+β-III тубулин-клетки) .

Таким образом, генетически модифицированные мононуклеарные клетки пуповинной крови могут быть не только клеточным носителем рекомбинантного гена, но дифференцироваться в разные клеточные типы ЦНС. В своих исследованиях мы впервые получили результаты о возможности генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови дифференцироваться в эндотелиальные клетки, клетки макро и микроглии в спинном мозге мышей с фенотипом бокового амиотрофического склероза. При этом направленность дифференцировки может быть обусловлена терапевтическим геном или задана специальными факторами дифференцировки.

ДЕБЮТНЫЕ МАСКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

Г.А. Прянишникова, ассистент кафедры неврологии РМАПО

со

о сч

сч

О!

Ранние стадии ВИЧ-инфекции протекают на фоне высокой вирусной нагрузки и характеризуются значительным риском передачи вируса половым путем. Заподозрить дебют заболевания в этот период бывает сложно, поскольку клинические симптомы неспецифичны и могут опережать сероконверсию. Чаще всего на ранних стадиях наблюдается острый ретровирусный синдром, напоминающий грипп или инфекционный мононуклеоз. Дебют с неврологических симптомов встречается реже и может проявляться асептическим менингитом, периферическими нейропатиями, преходящими психическими и когнитивными нарушениями. Совершенствование серологической и вирусологической диагностики позволяет установить факт инфицирования ВИЧ уже через неделю после заражения. В последнее время наметилась тенденция к более раннему началу противовирусной терапии. Ограничению распространения ВИЧ-инфекции способствует и уменьшение количества половых контактов улиц, осведомленных о своем заболевании.

Ключевые слова: острая ВИЧ-инфекция, ретровирусный синдром,сероконверсия.

Колоссальные усилия, направленные мировым сообществом на борьбу с ВИЧ-инфекцией, включая новые научные исследования, совершенствование методов диагностики и программ комбинированного лечения, постепенно меняют отношение к этой инфекции как к фатальному заболеванию. Раннее начало лечения позволяет не только увеличить продолжительность жизни больных, но и значительно снизить риск инфекционных осложнений и распространение инфекции в целом.

Тем не менее выявление ВИЧ-инфицированных пациентов и удержание их в программах оказания помощи до сих пор является достаточно сложной задачей . Проблема заключается в том, что ранние стадии заболевания могут не проявлять себя клинически, а специфические антитела синтезируются лишь спустя несколько недель после заражения. Риск же передачи вируса в этот период, напротив, значительно выше, чем при хронической инфекции, так как он обычно протекает на фоне высокой вирусной нагрузки (более 10 млн копий в 1 мл плазмы) . Согласно некоторым данным, в США предполагаемый диапазон

передачи ВИЧ при острой инфекции составляет от 8,6 до 50 % и коррелирует с высоким уровнем виремии .

В медицинской литературе понятие острой (первичной) ВИЧ-инфекции относится к периоду, следующему непосредственно после заражения до появления специфических антител, которое наблюдается через 2-6 месяцев у большинства больных. В это время вирус проникает в клетки, имеющие CD4-рецептор, и запускает синтез про-вирусной ДНК с её последующей интеграцией в геном клетки хозяина. Клинически это соответствует второй стации ВИЧ-инфекции — стадии первичных проявлений.

У большинства пациентов эта стадия может ограничиваться лишь выработкой специфических антител без клинических признаков инфекции (бессимптомная сероконверсия). Всё же при исследовании крови можно выявить снижение CD4-лимфоцитов (хелперов), лейкопению, гипер-гаммаглобулинемию, повышение сывороточного Р2-микроглобулина . Также имеются описания нескольких случаев транзиторной тром-боцитопении, которая протекала бессимптомно и не ассоциировалась с повышенным риском быстрого прогрессирования заболевания.

Реже первичная инфекция проявляется острым ретровирусным синдромом, напоминающим симптомы гриппа, гепатита А или инфекционного мононуклеоза. Дебют с неврологических нарушений случается в порядка 10-15 % случаев и включает асептический менингит, периферическую нейропатию (неврит лицевого нерва, синдром Гийена-Барре), а также когнитивные нарушения и психозы .

Первые симптомы инфекции появляются, как правило, в течение 2-4 недель после заражения, иногда чуть позже. Период клинических проявлений при острой ВИЧ-инфекции короткий, протекает на фоне умеренного транзиторного иммунодефицита и длится обычно не более 2-3 недель.

Манифестное течение острой сероконверсии при ВИЧ-инфекции — неблагоприятный признак быстрого прогрессирования заболевания. В сравнительных когортных исследованиях, оценивающих течение заболевания у пациентов с бессимптомным острым периодом и пациентов с наличием признаков ретровирусного синдрома или неврологическими нарушениями, развитие СПИДа наблюдалось в 4,6 раз чаще .

Выявление ВИЧ-инфекции на ранних стадиях заболевания является достаточно сложной задачей и не всегда распознается сотрудниками учреждений первичной медицинской помощи, так как клинические признаки в большинстве случаев неспецифичны и маскируются проявлением других заболеваний. Вышесказанное позволяет говорить о своего рода «дебютных масках» этого периода заболевания. Рассмотрим наиболее типичные из них.

Инфекционный мононуклеоз. Вызывается вирусом Epstein-Barr, обладающим тропизмом к В-лимфоцитам. Он является единственным вирусом герпетической группы, который вызывает пролиферацию, а не гибель клеток, в связи с чем происходит и гиперплазия лимфоузлов.

Е. Во^еаи е1: а1., обследовав 72 пациента с мононуклеозоподобным синдромом, выделили основные его признаки: лихорадка более 7 дней, лимфаденопатия, повышение печеночных ферментов (особенно АЛТ), лимфоцитоз более 40 % в периферической крови. Наличие трех из четырех указанных признаков, согласно этим данным, повышало вероятность диагностики на 20 % .

Лимфаденопатия — один из наиболее часто встречающихся признаков острой ВИЧ-инфекции и наблюдается, по разным данным, от 40 до 60 % . Чаще определяется увеличение подмышечных или шейных лимфоузлов. Лимфа-денопатию можно характеризовать несколькими особенностями:

• увеличенные лимфоузлы наблюдаются в двух или более несоприкасаемых областях тела, за исключением паховой;

• лимфоузлы не менее 1 см в диаметре, эластичные и не спаяны с кожей;

• увеличение лимфоузлов наблюдается длительно (более 3 месяцев);

• лимфаденопатия часто сочетается с гепато-спленомегалией.

Кроме того, должны быть исключены другие причины лимфаденопатии.

Такие симптомы, как лихорадка, утомляемость, недомогание, артралгии и миалгии, увеличение лимфоузлов, не являются специфичными и обычно не вызывают настороженности в отно-

шении острой ВИЧ-инфекции. Кроме того, при умеренной выраженности и непродолжительности этих проявлений больные обычно не считают нужным обращаться к врачу.

Сыпь, язвенные поражения слизистых оболочек ротовой полости и пищевода, кандидоз ротоглотки и менингизм являются более конкретными признаками и должны повысить индекс подозрений . В отличие от кандидозного эзофагита, кандидозный стоматит и фарингит могут наблюдаться в отсутствие иммунодефицита . Сыпь, как правило, наблюдается в 60-70 % при острой ВИЧ-инфекции в виде эритематозных или пятнисто-папулёзных элементов на лице и туловище, иногда на конечностях (включая ладони и подошвы) .

Согласно рекомендациям американских исследователей, исключать ВИЧ-инфекцию следует у любого пациента с гриппоподобным или моно-нуклеозоподобным синдромом, если:

• заболевание сопровождается сыпью (А2) или асептическим менингитом (А2;

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

• пациент сообщает о недавнем сексуальном контакте с ВИЧ-инфицированным или человеком, подозрительным в отношении ВИЧ-инфекции (А2);

• пациент недавно выявил заболевание, передающееся половым путем (А2);

• а также у беременных (А3) или пациентов, обратившихся по поводу обследования на ВИЧ (А3) .

Асептический менингит. Вирус иммунодефицита является непосредственной причиной менингита или энцефалита в 9-24 %, который, как правило, развивается в момент сероконверсии к ВИЧ . Некоторые исследователи считают, что острый менингит или энцефалит можно рассматривать как часть острого ретровирус-ного синдрома . Клиническими признаками асептического менингита являются головные боли, лихорадка, менингеальные знаки, в некоторых случаях — поражение черепных нервов, спутанность сознания и сонливость. Примерно в половине случаев менингит может протекать в атипичной стертой форме, единственными проявлениями которого будут головная боль и плеоцитоз в ликворе, иногда менингит протекает бессимптомно . В большинстве случаев данная патология носит самоограничивающийся характер и не требует специального лечения, кроме назначения анальгетиков. В спинномозговой жидкости обычно наблюдается умеренное повышение белка, лимфоцитарный плеоцитоз, повышение индекса иммуноглобулинов, иногда — олигоклональные антитела. В исследовании, включающем изучение ликвора у 24 пациентов, плеоцитоз более 5 кл/мкл наблюдалось у 15 (62 %), а ВИЧ был выделен из ликвора у 12 (50 %) .

При нарастании иммунодефицита плеоцитоз обычно исчезает. Менингит может принимать

со

о сч

сч

О!

со

о

изначально хроническое течение в случае выраженного иммунодефицита (если количество CD-4 клеток составляет 200-500 в мкл) .

Причиной менингита при ВИЧ-инфекции также могут быть различные микроорганизмы, поэтому важно дифференцировать это состояние от нейросифилиса или другой оппортунистической инфекции. При ВИЧ-менингите в ликворе повышено количество CD8-, а не CD4-клеток, как при другом вирусном менингите .

Поскольку иммуноферментные тесты обычно отрицательны у пациентов с острой ВИЧ-инфекцией, диагноз может быть установлен путем обнаружения вирусного антигена р24 либо значительного количества РНК-копий ВИЧ-1 в крови . Рутинная МРТ патологии, как правило, не выявляет.

Когнитивные и психические нарушения.

Преходящие когнитивные и психические нарушения могут развиваться при острой ВИЧ-инфекции в рамках менингоэнцефалита и нередко сопровождаются дезориентацией, угнетением сознания, иногда эпиприпадками . Для ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных нарушений характерны забывчивость, снижение концентрации внимания. Важной особенностью является замедление психомоторной реакции и увеличение времени выполнения заданий.

Иногда обращает на себя внимание не только замедленность вербального ответа, но и движений. При осмотре можно выявить замедление быстрых саккадических движений глаз, колебания глазного яблока при фиксации взгляда, нарушение следящих движений.

Пациенты часто бывают апатичны, раздражительны, эмоционально лабильны.

Кроме того, когнитивные нарушения могут быть также обусловлены длительным употреблением психоактивных препаратов. По данным некоторых авторов, злоупотребление алкоголем и наркотиками среди ВИЧ-инфицированных пациентов может доходить до 50 % .

При обследовании нередко обнаруживается лимфаденопатия, спленомегалия, макулопапу-лезная сыпь. В ликворе наблюдается умеренный лимфоцитарный плеоцитоз; МТР, как правило, патологии не выявляет. Когнитивные нарушения регрессируют через несколько недель или переходят в хроническую ВИЧ-энцефалопатию.

Точный механизм возникновения когнитивных нарушений при ВИЧ-инфекции неизвестен, но потенциально он видится в размножении вируса в ЦНС. Проведенные исследования показали, что вирусная РНК может обнаруживаться в мозге инфицированных с уже первых недель заболевания .

Большое значение имеет заражение вирусом моноцитов, с помощью которых вирус проникает в ЦНС (в роли «троянского коня»), где эти клетки превращаются в макрофаги, а вирус продолжа-

ет репликацию в них. Нейроны имеют низкую восприимчивость к ВИЧ, а нарушение их функции, вероятно, связано с заражением соседних микроглиальных клеток и макрофагов. Инфицированные ВИЧ микроглиальные клетки начинают продуцировать низкомолекулярные пептиды, воздействующие на NMDA-рецепторы астроци-тов. Поскольку астроциты участвуют в активном захвате глутамата, выделяемого нейронами в синаптическую щель, нарушение их нормального функционирования приводит к избыточному накоплению этого медиатора в экстрацеллюлярном пространстве, перевозбуждению нейронов. Возникающий при этом каскад патобиохимических реакций — активация перекисного окисления липидов ведет в конечном итоге к деструкции мембран нейронов и их гибели. В условиях повышенной проницаемости гематоэнцефалического барьера фрагменты нейрональных мембран попадают в кровоток, запуская синтез аутоантител к мозговой ткани .

Кроме того, употребление метамфетамина и ко-инфекции гепатита С может усилить повреждения ЦНС путем дальнейшей активизации неин-фицированных макрофагов и клеток микроглии.

Периферические нейропатии. Поражение периферических нервов встречаются почти у половины ВИЧ-инфицированных и может возникать на любом этапе заболевания. На ранних стадиях обычно наблюдается острая воспалительная демиелинизирующая полирадикулонейропатия (ОВДП) или синдром Гийена-Барре, дистальная сенсорная полинейропатия, нейропатия лицевого нерва. Эти состояния могут быть одним из первых признаков сероконверсии.

Среди иммунопатологических механизмов развития периферических нейропатий большое значение придается воздействию провоспали-тельных цитокинов, избыточному синтезу аутоантител, недостаточности фактора роста нервов.

Клиническая картина ВИЧ-ассоциированной ОВДП включает нарастающую мышечную слабость в конечностях, арефлексию, чувствительные и вегетативные нарушения, т. е. не отличается от синдрома Гийена-Барре у лиц без иммунодефицита и считается следствием транзиторного нарушения иммунных реакций, приводящих к демиелинизации периферических нервов. По некоторым данным, ВИЧ-ассоциированная ОВДП в большинстве случаев протекает бессимптомно. Электрофизиологические исследования выявляют замедление или блок проведения по двигательным нервам, удлинение или отсутствие F-волны, признаки денервации и поражения аксонов.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Отличительной особенностью ОВДП у ВИЧ-инфицированных является наличие умеренного лимфоцитарного плеоцитоза в ликворе с самого начала заболевания (что, вероятно, связано с наличием асептического менингита). В этих случаях

требуется обязательное обследование пациентов на ВИЧ-инфекцию, даже если недавние исследования показывали отрицательный результат.

Дистальная сенсорная полинейропатия считается самым частым типом поражения периферических нервов и встречается примерно у 30 % ВИЧ-инфицированных . Некоторые исследователи относят ее к атипичному варианту ОВДП . Нарушения чувствительности возникают в стопах и поднимаются постепенно вверх, больные жалуются на постоянные боли жгучего характера. Неврологический осмотр выявляет нарушение болевой и вибрационной чувствительности, утрату ахилловых рефлексов, сенситивную атаксию.

Краниальная нейропатия (чаще наблюдается нейропатия лицевого нерва) может сочетаться с поражением спинальных волокон. В основе поражения периферических нервов лежит иммуно-комплексный васкулит, приводящий к гипоксии и метаболическим нарушениям нервного волокна, возникновению фокальной аксонопатии .

По данным биопсии, снижение плотности дистальных участков волокон кожных нервов в значительной степени коррелирует с низким содержанием СЭ-4 клеток в периферической крови и высоким уровнем плазменной РНК ВИЧ-1 .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявление ВИЧ-инфекции на ранних стадиях заболевания — задача довольно сложная. Клинические признаки острого периода заболевания очень напоминают другие инфекции и патологические состояния, в том числе неврологические. Кроме того, пациенты часто не признают, что, возможно в последнее время могли быть подвержены заражению ВИЧ.

Но даже заподозрив ВИЧ-инфекцию, при скрининговом обследовании, включающем определение противовирусных антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) в сочетании с иммуноблоттингом (ИБ), можно не получить

лабораторного подтверждения. Сероконверсия обычно происходит в половине случаев в течение двух месяцев, а в 95 % — в течение шести месяцев после заражения . Очевидно, что данный алгоритм не позволяет выявить раннюю инфекцию, наиболее опасную в эпидемиологическом плане. Многочисленные когортные исследования убедительно показали, что вероятность трансмиссии ВИЧ во время острой инфекции более чем в 20 раз выше, чем в период установившейся стадии заболевания .

Внедрение в практику тестов для выявления антигена ВИЧ-1 р24 сделало возможным сократить период «серологического окна» до 2-3 недель. Современные тест-системы направлены на определение в образце одновременно антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и антигена к ВИЧ-1 р24, что позволяет выявить до 80 % новых случаев заражения. Выявление нуклеиновых кислот — РНК ВИЧ в плазме крови позволяет установить факт инфицирования уже через неделю после заражения (рисунок).

Данные, касающиеся определения вирусной нагрузки в плазме крови в период острой ВИЧ-инфекции, разноречивы. Так, согласно одним исследованиям, уровень виремии существенно не отличается у пациентов с наличием клинических проявлений острой инфекции и без них . По другим данным, вирусная нагрузка в плазме крови была значительно выше у пациентов с плеоцитозом, чем у пациентов с бессимптомной сероконверсией . Тем не менее в начале заболевания вирусная нагрузка достигает больших значений. Высокие уровни РНК ВИЧ, обнаруживаемые в плазме при использовании ПЦР в сочетании с отрицательным или сомнительными результатами скрининга на ВИЧ, поддерживают предположительный диагноз острой ВИЧ-инфекции.

При низких показателях виремии по результатам определения вирусной нагрузки (< 5000 копий на 1 мл) в отсутствие серологического подтверждения ВИЧ-инфекции обследование

Рисунок. Динамика появления лабораторных маркеров ВИЧ-инфекции

Источник: J. AIDS. Vol. 55, Suppl. 2, Dec. 15, 2010, с изм.

О (N

(N

со

о

следует повторить в динамике для исключения ложноположительного результата .

В последнее время исследователи склоняются к более раннему началу противовирусной терапии, расширению показаний для АРТ.

Эффективность антиретровирусной терапии в условиях более низкого уровня виремии в начале заболевания была неоднократно подтверждена в повторных контрольных исследованиях. Кроме того, пациенты с установленным диагнозом ВИЧ-инфекции на ранних стадиях болезни в значительной степени уменьшают количество половых контактов, что в перспективе способствует ограничению распространения этой инфекции.

Литература

1. Бартлетт Дж., Редфилд Р., Плам Ф., Мазус А.И. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции. Российское издание. — М.: ГРАНАТ, 2013. -696 с.

2. Биллер Х. Практическая неврология. Том 2. Лечение. — М.: Мед. литература, 2005. — 416 с.

3. Яковлев Н.А., Жулёв Н.М., Слюсарь Т.А. Ней-роспид. Неврологические расстройства при ВИЧ-инфекции/СПИДе. — М.: МИА, 2005. — 278 с.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

7. Daar E., Little S., Pitt J., Santangelo J. Diagnosis of primary HIV-1 infection // Ann. Intern Med 2001;134:25.

10. Kahn J.O., Walker B.D. Acute human immunodeficiency virus type 1 infection // N Engl J Med 1998; 339 (1): 33-39.

The debut of the mask HIV

G. A. Pryanishnikova, assistant Professor, Department of neurology, Russian medical Academy of postgraduate education